1499, Vatican : Ezio Auditore

Brotherhood débute juste après la fin de Assassin's Creed II. Ezio s'enfuit du Vatican avec son oncle Mario et rejoint Monteriggioni en possession de l'Orbe d'Eden. Cesare Borgia, le fils de Rodrigo, attaque la cité et la villa en janvier 1500. Il s'empare de l'Orbe et tue Mario. Ezio part ensuite pour Rome rejoindre Machiavelli, un puissant allié au sein des assassins italiens. La capitale est dominée par la famille Borgia et Cesare a pour but de prendre le contrôle de toute l'Italie. Il n'en faut pas plus à Ezio pour qu'il recrute de nouveaux assassins et forme une armée, la Confrérie, afin de reprendre la ville. Durant son périple Ezio voit Cesare tuer son propre père, Rodrigo, et apprend où le fragment d'Eden est caché. L'assassin s'en empare et renverse Cesare Borgia qui sera ensuite arrêté pour meurtre (celui de Rodrigo) et inceste (avec sa soeur Lucrezia) en 1503. Mais Cesare promis de revenir et Ezio utilisa la pomme d'Eden pour le retrouver en 1507 afin de lui régler définitivement son compte. Ezio cachera ensuite le fragment en lieu sûr.

Octobre 2012, Rome : Desmond Miles

Grâce à la dernière mémoire d'Ezio, Desmond sait désormais où son ancêtre a caché l'Orbe d'Eden. C'est donc sous le Colisée de Rome que les assassins modernes retrouvent le fragment ainsi que plusieurs hologrammes des leaders de la "première civilisation". Desmond active finalement l'Orbe et perd le contrôle de son corps. Des voix venant des hologrammes poussent alors Desmond à poignarder Lucy afin "d'ouvrir la voie"... Le jeu s'achève ainsi sur la mort de la plus vieille alliée de Desmond.